双向电泳设备技术的应用及其发展前景

添加时间：2016-10-5 13:57:00

一、前言
双向电泳设备（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是蛋白分离的黄金标准，由此可 以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。双向电泳分离技术利用复杂蛋白 混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域 的中心技术。
迄今为止，双向电泳技术一直是使用昂贵的专门仪器，要求大实验室的积累和专门的训练。为了保证结果的重复性，需要延长时间和技术专家 的建议。
二、摘要
电泳是在溶剂中通过电场转移带电分子，任何带电的离子或者基团放置在电场中都将会迁移。除非在它们的等电点，大多数生物聚合物在任何 pH值时都带有净电荷，它们将会以与电荷密度成比例的方式移动，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带。分 子在电场中的迁移取决于电场的强度、净电荷、分子的大小和形状、离子强度、粘度和分子移动介质的温度。作为一种分析工具，电泳简单、 快速，并且具有高灵敏度。用来研究单一、带电荷的分子的特性，也用来作为一种分离技术。
双向电泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是一项基于蛋白的两种不同特性：电荷和质量来分离蛋白的技术。首先基于蛋白固 有电荷，通过等电聚焦（isoelectric focusing IEF）进行第一向蛋白分离，然后根据蛋白的质量，在第二向中通过SDS-PAGE电泳进行蛋白分 离。使用这两种不同的分离技术的结果是增高了对蛋白的分辨率。
三、双向电泳实验原理
IEF/SDS-PAGE双向电泳法1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/Sd S-PAGE双向电泳。其中IEF电泳（ 管柱状）为第一向，SDS-PAGE为第二向（平板）。在进行第一向IEF电泳时，电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。蛋白 质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。
2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分 离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
IEF电泳结束后，将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液（内含SDS、β-巯基乙醇）中振荡平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端，即 可进行第二向电泳。
IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质（包括核糖体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。 四、实验操作步骤（双向电泳中一律使用超纯水）
（一） 样品的溶解
取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一 次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
（二） Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在 每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过 滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。 标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知，相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值。 比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。 （三）水化液的制备
称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心 15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
（四）第一向等电聚焦
1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。
3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。
4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。 否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶 条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气 泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑 膜上。
9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
（五）第二向SDS-PAGE电泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水 饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
4. 配制胶条平衡缓冲液I。
5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条 上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。同轴电缆这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹 。
6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7. 配制胶条平衡缓冲液II。
8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或 损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的 顶部对着自己。
10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或 损坏凝胶表面）。
13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。 其余胶条同样操作。
14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊 子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再 加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
20.进行染色。
注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。
五、应用前景
双向电泳技术是蛋白质组学研究的基础技术平台.应用双向电泳技术分离肿瘤与正常组织细胞之间的差异表达蛋白可为寻找肿瘤的特异标志物、 揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式及治疗药物等提供新途径.
电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便， 具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。