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电泳(电泳设备)分析常用方法

添加时间:2016-10-5 13:57:00

(一)醋酸纤维素薄膜电泳设备
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎 能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速 度快,电泳时间短,样品用量少,5μg 的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。
⒈材料与试剂 醋酸纤维素膜一般使用市售商品,常用的电泳缓冲液为pH8.6 的巴比妥缓冲液,浓度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要点
⑴膜的预处理:必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液,浸透后,取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液,不可吸得过干。
⑵加样:样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析,每 cm加样线不超过1μl,相当于 60-80μg的蛋白质。
⑶电泳:可在室温下进行。电压为25V/cm,电流为0.4-0.6mA/cm宽。
⑷染色:一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红,糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff 试剂,脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。
⑸脱色与透明:对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定,可浸入冰醋酸:无水乙醇=30:70 (V/V)的透明液中。
(二)凝胶电泳
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法 称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶
孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广,介绍如下:
⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其 它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床 生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。
⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,DNA 分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比;分子构型也对 迁移率有影响,如共价闭环 DNA>直线DNA>开环双链DNA。当凝胶浓度太高时,凝胶孔径变小,环状DNA(球形)不能进入胶中,相对迁移率为 0,而同等大小的直线DNA
(刚性棒状)可以按长轴方向前移,相对迁移率大于 0。
⑴设备与试剂:琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶,而且制胶与加样都比较方便,故应用比较广泛 。核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有 TBE(0.08mol/L Tris·HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/L EDTA)和THE(0.04mol/L Tris·HCl。pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/L EDTA)。
⑵凝胶制备:用上述缓冲液配制0.5%-0.8%琼脂糖凝胶溶液,沸水浴或微波炉加热使之融化,冷至55℃时加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5 μg/ml,然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中,厚度依样品浓度而定。注胶时,梳齿下端距玻璃板 0.5-1.0mm,待脱凝固后,取 出梳子,加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下 1mm处。
⑶样品制备与加样:溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料(0.025%溴酚蓝或桔黄橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%),也可使用 2.5%FicoⅡ增加比重,使样品集中,每齿孔可加样 5-10μg。
⑷电泳:一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。
⑸样品回收:电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况,对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收,如电泳洗 脱法:在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶,将其装入透析袋(内含适量新鲜电泳缓冲液),扎紧透析袋后,平放在水平型电泳槽两电极之间的 浅层缓冲液中,100V电泳2-3小时,然后正负电极交换,反向电泳2分钟,使透析袋上的DNA释放出来。吸出含 DNA的溶液,进行酚抽提、乙醇沉 淀等步骤即可完成样品的回收。
其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等,但各种方法都仅仅有利于小分子量 DNA片段(<1kb)的回收,随着DNA分子量 的增大,回收量显著下降。
(三)等电聚焦电泳技术
等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)同轴电缆是60年代中期问世的一种利用有pH 梯 度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
⒈IEF的基本原理 在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的 特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一 pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的 pH恰好等于聚焦蛋白质分子的 等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组 分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有 pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的 pH位置上,形成分离的蛋白质区带。
⒉pH梯度的组成 pH梯度的组成方式有二种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度 的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极 端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示。电泳开始后,混合物中 pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1 ,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。 pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2>pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有 不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度,如图 16-3所示。
⒊两性电解质载体与支持介质 理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导,前者保证pH梯度的稳定,后者允许一定的电流通过。 不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小,易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的 高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。
常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。
电泳后,不可用染色剂直接染色,因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合,因此应先将凝胶浸泡在5%的三氯醋酸中去除两性电解质, 然后再以适当的方法染色。
(四)其他电泳技术
⒈IEF/SDS-PAGE双向电泳法 1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了 IEF/SD S-PAGE双向电泳。其中IEF电 泳(管柱状)为第一向,SDS-PAGE 为第二向(平板)。在进行第一向IEF电泳时,电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40。 蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。IEF电泳结束后,将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处 理液(内含SDS、β-巯基乙醇)中振荡平衡,然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端,即可进行第二向电泳。
IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质(包括核糖体蛋白、组蛋白等)的分离是极为精细的,因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。 ⒉毛细管电泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法,即微柱胶电泳,均一浓度的凝胶是将 毛细管浸入凝胶混合液中,使凝胶充满总体积的2/3左右,然后将其揿入约厚2mm的代用粘土垫上,封闭管底,用一支直径比盛凝胶的毛细管更 细的硬质玻璃毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后,除去水层并用毛细管加蛋白质溶液(0.1-1.0μl,浓度为1-3mg/ml)于凝胶上,毛细管的空隙 用电极缓冲液注满,切除插入粘土部分,即可电泳。
目前毛细管电泳分析仪的诞生,特别是美国生物系统公司的高效电泳色谱仪为 DNA片段、蛋白质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速 、有效的途径。高效电泳色谱法是将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体,在从凝胶中洗脱样品时,连续的洗脱液流载着分离好的成 分,通过一个连机检测器,将结果显示并打印记录。高效电泳色谱法既具有凝胶电泳固有的高分辨率,生物相容性的优点,又可方便地连续洗 脱样品。
各电泳法,除另有规定外,照下述方法操作。
一、纸电泳法
1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图,包括两个电泳槽 A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧 的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板 C分成两部分;外格装有铂电极(直径0.5~0.8cm)D;里格为可放滤纸 E的有机玻璃电泳槽架F,此架 可从槽中取出;两侧电泳槽A内的铂电极 D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。 电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在 100 ~500V,高压电泳一般在500~10 000V。
2. 操作法
(1) 电泳缓冲液
枸橼酸盐缓冲液(pH3.0) 取枸橼酸 (C6H8O7·H2O)39.04g 与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水 4000ml,使溶解。
(2) 滤纸
取色谱滤纸置 1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH 值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽 18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端 5~8cm处划一起始线,每隔2.5~3cm 处做一记号备点样用。
(3) 点样 有湿点法和干点法。
湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端, 将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点 10μl,共3点,并留 2个空白位置。
干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处最后喷湿,本 法适用于稀的供试品溶液。
(4) 电泳
于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为 18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置 紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。
(5) 含量测定
剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号 垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。
二、醋酸纤维素薄膜电泳法
1.仪器装置
电泳室及直流电源同纸电泳。
2.试剂
(1) 巴比妥缓冲液(pH8.6)
取巴比妥 2.76g,巴比妥钠15.45g,加水溶解使成1000ml。
(2) 氨基黑染色液
取 0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3) 漂洗液
取乙醇 45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。
(4) 透明液
取冰醋酸 25ml,加无水乙醇75ml,混匀。
3.操作法
(1) 醋酸纤维素薄膜
取醋酸纤维素薄膜,裁成 2cm×8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓 冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。
(2) 点样与电泳
于膜条上距负极端 2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2~3μl,在 10~12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4~5cm为宜。
(3) 染色
电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2~3 分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为止。
(4) 透明
将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中 10~15分钟,取出平铺于洁净的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长期保存 。
(5) 含量测定
未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对百分含量。 洗脱 法 将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,至洗脱完全, 于一定波 长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位,同法操作作对照。先计算吸收值总和,再计算各蛋白组分所占百分率。 扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 (未透明薄膜) 或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图,横坐标 为膜条的长度,纵坐标为吸收度,计算各蛋白组分的百分含量。
亦可用微机处理积分计算。
三、琼脂糖凝胶电泳法
1.仪器装置
电泳室及直流电源同纸电泳。
2.试剂
(1) 醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)
取冰醋酸 50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节pH至3.0,再加水至1000ml。
(2) 甲苯胺蓝溶液取甲苯胺蓝 0.1g,加水100ml使溶解。
3.操作法
(1)制胶
取琼脂糖约 0.2g,加水10ml,置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)10ml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm× 7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度约 3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。 (2) 标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下 规定配制。
(3) 点样与电泳
在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样 1μl,立即接通电源, 在电压梯度约 30V/cm,电流强度1~2mA/cm的条件下,电泳约20分钟,关闭电源。
(4) 染色与脱色
取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
1.仪器装置
通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极,铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂
(1)溶液 A
取三羟甲基氨基甲烷 36.6g,四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml,再加水溶解并稀释至 100ml,置棕色瓶内,在冰箱中保存。
(2)溶液 B
取丙烯酰胺 30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀释至100ml,滤过,置棕色瓶内,在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3)
取三羟甲基氨基甲烷 6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml,置冰箱中保存,用前稀释 10倍。
(4)溴酚蓝指示液
取溴酚蓝 0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解,加 20%乙醇制成250ml。
(5)染色液
取 0.25%(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至 10ml。
(6)稀染色液
取上述染色液 2ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备
照各药品项下的规定。
(3)电泳
将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内,每管加供试品或标准品溶液50~100μl,为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚 蓝指示液 1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴,玻璃管的上部用电极缓冲液充满,上端接负极、下端接正极。调节起始电 流使每管为1mA,数分钟后,加大电流使每管为 2~3mA,当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处,关闭电源。
(4)染色和脱色
电泳完毕,用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入,胶条即从管内滑出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡 10 ~30分钟,以水漂洗干净,再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。
(5)结果判断将胶条置灯下观察,根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。
相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R''<[m]>)进行比
较。其计算式如下: 进胶端到供试品或标准品区带的距离 相对迁移率(R''<[m]>)=──进胶端到溴酚蓝区带的距离 扫描 将清晰的胶条置 双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分,由各组分的峰面积计算百分含量。7%醋酸溶液。
3.操作法
(1)制胶
取溶液 A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混匀,抽气赶去溶液中气泡, 加 0.56%过硫酸铵溶液2ml,混匀制成胶液,立即 用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达 6~7cm, 然后徐徐滴加水少量,使覆 盖胶面,管底气泡必须赶走,静置约 30分钟,待出现明显界面时即聚合完毕,吸去水层。
五、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子 所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷,消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R''<[m]>)的大小完全取决于分子量 的高低,因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
1.仪器装置
除另有规定外,同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.试剂
(1)丙烯酰胺液溶
称取丙烯酰胺 22.2g与双丙烯酰胺0.6g, 溶于100ml水中,贮于褐色瓶中低温保存。
(2) 凝胶缓冲液
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、 磷酸氢二 钠(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g与十二烷基硫酸钠2.0g,加水至1000ml(若有沉淀析出,可加 温至 37℃溶解)。
(3)电泳缓冲液
将凝胶缓冲液稀释 1倍。
(4)染色液
称取 25mg考马斯亮蓝R<[250]>,溶于57%乙醇与9.2%醋酸混合液100ml中。
(5)脱色液
取无水乙醇 75ml,加冰醋酸50ml,用水稀释至1000ml。
3.操作法
除下列规定外,其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(1)制胶
用丙烯酰胺溶液-凝胶缓冲液-水-1.6%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺(需冷却)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。
(2)标准蛋白溶液及供试品溶液的制备
取标准蛋白,加水制成每1ml中含2~5mg的溶液,与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠 0.04g,溶于40ml水中)1∶3混合,置冰箱中过夜。 供试品照上述方法配制。
(3)电泳 调节电流使每管为 8mA。
4.相对迁移率和分子量计算
将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移 率: 蛋白移动的距离 染色前的胶条长度 相对迁移率(R''<[m]>)=───×─── 脱色后的胶条长度 染料移动的前沿距离 以 R''<[m]> 为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出供试品分子量。


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